В 1492 году Колумб, отправившийся на поиски западного пути в Индию, открыл, сам того не зная, новый обширный материк, названный впоследствии Америкой. По следам Колумба тотчас же устремились испанские конкистадоры - искатели легкой наживы. Один из них, Родриго де Бастидас, в 1501 году наткнулся на побережье нынешней Панамы. В 1502-1503 годах Колумб во время своего четвертого, последнего, путешествия обследовал в поисках пролива, который вел бы дальше на запад, побережье Центральной Америки. Уверенность в существовании такого пролива подкреплялась рассказами индейцев о какой-то узкой полосе, лежащей между двумя обширными морями, - испанцы думали, что индейцы имеют в виду проход, связывающий океаны. Обнаружить такой проход так и не удалось, но в реках, впадающих в Караибское море, было найдено золото, и в результате в 1509 году на берегах Дарьенского залива возникла первая испанская колония. Во главе ее вскоре оказался Васко Нуньес Бальбоа.
В 1513 году Бальбоа, наслушавшись рассказов местных индейцев о могучем океане, лежащем за горами, и богатых золотом странах, расположенных на его побережье, отправился на его поиски. По рассказу летописца, "Бальбоа, укрепившись в Дарьене, приступил к поискам золота, о котором он так много слышал. Он, завел много знакомых среди вождей соседних индейских племен. Самый богатый из касиков (вождей) Комогре встретил прибывшего к нему в гости Бальбоа дарами золота. Когда испанцы стали ссориться между собой из-за золота, присутствовавший при этом сын вождя презрительно заметил: "Если вы так жадны до этого металла, то знайте, что дальше на юг есть земля, где люди пьют и едят из золотых сосудов". Так испанцы впервые узнали о Перу. "В шести днях пути отсюда, - продолжал индеец, - лежит другой океан, такой же большой, как тот, что лежит сейчас перед вами. На его берегах и находится то царство, о котором я говорю. Но его владыки могучи. Чтобы напасть на него, вам нужно гораздо больше людей, чем у вас сейчас имеется". Бальбоа и его спутники, в числе которых был и Писарро, будущий завоеватель Перу, внимательно слушали индейца. Вскоре Бальбоа отправился на поиски".
Чтобы добраться до гор, с которых, по словам индейцев, можно было увидеть этот океан, надо было пройти километров сто на юг через тропические леса. Путь этот оказался настолько трудным, что Бальбоа и его спутники затратили на него двадцать дней. 25 сентября 1513 года Бальбоа первый из европейцев увидел воды неизвестного океана, который он назвал Южным морем (Магеллан назвал его несколько позже Тихим океаном), а 29-го он спустился на его побережье и объявил его и все прилегающие к нему земли собственностью испанского короля. Несколько позже Бальбоа предпринял новую экспедицию к Южному морю. На этот раз порабощенные индейцы перетащили туда на своих плечах все необходимое для постройки нескольких небольших суденышек, на которых Бальбоа проехал вдоль побережья, открыв при этом Жемчужные острова. Бальбоа собирался уже отправиться на поиски золотой страны, но судьба его сложилась иначе: завистники ложно обвинили его в измене, и он был казнен. Однако испанцы уже обосновались на Тихоокеанском побережье. В 1519 году здесь был основан город Панама, куда был перенесен центр "Золотой Кастилии" (так назывались тогда испанские владения в южной части Центральной Америки).
Испанские завоеватели обложили коренное индейское население тяжелой данью. Покоренная земля была обильно полита кровью порабощенных индейцев: часть их была истреблена испанцами за "непослушание", остальные быстро вымирали от непосильного труда и завезенных европейцами болезней. Чтобы восполнить недостаток рабочей силы, испанцы стали завозить в Панаму, как и в другие американские колонии, рабов-негров. История Панамы времен испанского владычества заполнена восстаниями индейцев и негров, которые беспощадно подавлялись захватчиками.
Новый город Панама очень скоро приобрел важное значение и стал одним из главных центров испанской колонизации в Центральной и Южной Америках. Отсюда отправился в поход и Франсиско Писарро, в прошлом соратник Бальбоа, осуществивший его мечту о завоевании Золотой Земли (Перу). С завоеванием Перу значение Панамы еще более возросло, ибо через нее проходил путь, связывавший Испанию с ее новыми богатыми владениями на западном побережье Южной Америки. Через Панамский перешеек проходили несметные сокровища, награбленные испанцами в Перу, для отправки в метрополию. Их доставляли из Перу на кораблях, перевозили через перешеек, а затем снова нагружали на корабли, следовавшие под конвоем военных судов в Испанию (обычно через Гавану на Кубе, где был сборный пункт судов, приходивших с ценными грузами из разных мест испанских владений). Чтобы подчеркнуть значение Панамы, испанский король присвоил этому городу титул "весьма благородный и весьма верный" (muy noble y muy leal) и уравнял его в правах с важнейшими городами Испании. Но уже тогда, как и теперь, значение города Панамы определялось его транзитным и стратегическим значением; поблизости от него почти не было сельского населения, потому что, хотя люди охотно заезжали сюда по пути к какому-либо другому месту назначения, лишь очень немногие оседали здесь. По этой причине испанская Панама, при всем своем значении, оставалась небольшим городом, население которого никогда не превышало двух-трех десятков тысяч человек.
Еще в первой половине XVI века от Панамы была проложена через перешеек мощеная столбовая дорога к Караибскому побережью, где перевалочным центром стал Номбре-де-Дьос. В середине XVI века для облегчения пути была использована река Чагрес, по которой курсировали плоскодонные лодки.
Однако многократные перегрузки крайне затрудняли и удорожали перевозку; поэтому, как только было окончательно установлено отсутствие в Центральной Америке пролива, связывающего Атлантический океан с Тихим, начали появляться проекты создания канала между ними. Первый из этих проектов принадлежал одному из соратников Бальбоа - Альваро де Сааведра Серой, который в 1529 году предложил прорыть канал через перешеек почти в том же месте, где ныне проложен Панамский канал. Идея Сааведры заинтересовала испанского короля Карла V (бывшего в то же время германским императором); он приказал обследовать перешеек и установить возможность проведения здесь канала. К середине XVI века были уже выявлены те четыре места, где мог бы пройти канал. Но Испания шла уже под гору. Все сильнее становились ее соперники на море, в частности Англия, которая несколько позже, в 1588 году, нанесла Испании сильнейший удар, уничтожив ее мощный флот - "непобедимую Армаду". Быстрый рост морского могущества Англии вызывал у испанского короля Филиппа II, сына и наследника Карла V, боязнь, что, если канал будет проведен, у Испании нехватит сил удержать его за собой, и лучший путь к тихоокеанским владениям Испании - "ключи мира", по выражению известного английского моряка и пирата Дрейка, - окажется в руках ее смертельного врага - Англии. Под эти весьма материальные соображения Филипп II подвел "духовную" базу, заявив: "что бог соединил, человек да не разъединяет", и на этом основании, запретил под страхом смерти заниматься проектами и изысканиями для строительства канала.
Опасения Филиппа II подкреплялись вое более частыми нападениями английских пиратов на испанские суда, доставлявшие в Испанию сокровища Нового Света. Не помогало ни вооружение судов, ни отправка их целыми эскадрами, под защитой военных кораблей. Вскоре английские пираты при поддержке правительства перешли к нападениям на испанские базы в Америке. Большую помощь им оказывали порабощенные испанцами индейцы и негры, видевшие в пиратах союзников в борьбе со своими угнетателями.
Особое внимание англичане уделяли Панамскому перешейку. Они неоднократно захватывали и грабили Номбре-де-Дьос, а позже Пуэрто-Бельо, сменивший Номбре-де-Дьос в качестве караибской оконечности дороги через перешеек. В 1671 году английские пираты под руководством Генри Моргана пересекли перешеек, захватили город Панаму, разграбили и сожгли его. От города осталась только груда развалин. В награду за "подвиги" английский король произвел Моргана в дворянство, назначил вице-губернатором острова Ямайки и поручил ему... охрану морского судоходства от пиратов.
Испанцы построили в нескольких километрах от разрушенной Морганом старой Панамы новый город, также названный Панамой и существующий до настоящего времени. Однако из-за постоянной угрозы нападения пиратов значение пути через Панамский перешеек постепенно падало. В XVIII веке торговля Испании с ее тихоокеанскими владениями велась обходным путем, вокруг Южной Америки, лишь небольшая ее часть проходила через Панаму, ставшую далекой окраиной испанского вице-королевства Новая Гранада, ядром которого была нынешняя Колумбия.
Развитие капитализма и рост мировой торговли привели к тому, что с конца XVIII века идея сооружения канала через Центральную Америку стала постепенно приобретать все более широкое распространение. Испанское правительство сняло двухсотлетний запрет и приступило к изысканиям с целью выбора лучшей трассы для канала, однако час испанского владычества уже пробил: захват Испании Наполеоном, а затем отделение американских колоний от Испании сорвали реализацию этих планов.